Понимание того, как устроен белок, дает ценные ключи к разгадке его функций. Развитие кристаллографии белков в 1930-х и 1950-х годах впервые позволило увидеть несколько белковых структур, но постепенно стало очевидно, что большая часть белков не имеет единой установленной структуры, что делает их недоступными для рентгеновской кристаллографии. Поскольку они слишком тонкие для электронной микроскопии, единственными жизнеспособными альтернативами для многих из этих внутренне неупорядоченных белков (IDP) являются ядерная магнитно-резонансная томография и малоугловое рентгеновское рассеяние.
Данные, собранные с помощью этих методов, усредняются по ансамблям и поэтому не дают четких указаний об индивидуальных конформациях белков или о том, как часто они возникают. С другой стороны, атомно-силовая микроскопия способна создавать биологические изображения с наноразмерным разрешением на высокой скорости, поэтому она может фиксировать динамику, а также структуры белков.
В этой последней работе исследователи из Университета Канадзавы вместе с сотрудниками из Японии, Франции и Италии применили этот метод к изучению нескольких ВПЛ и определили параметры, определяющие форму, размер и длину цепи участков белка, а также степенной закон, относящийся к размеру белка. к длине белка, и количественное описание влияния поверхности слюды на размеры белка. Динамика конформаций белков, зафиксированная благодаря высокоскоростным возможностям метода, позволила выявить глобулы, которые появляются и исчезают, а также трансформации между полностью неструктурированными и слабо сложенными конформациями в сегментах длиной до 160 аминокислот.
Исследования нуклеопротеина вируса кори, в частности, помогли определить не только форму и размеры, но и характеристики переходов порядок-беспорядок в области, ответственной за молекулярное распознавание, что позволяет вирусам идентифицировать факторы хозяина, чтобы они могли воспроизводиться. Они также могут определить более крупномасштабные структуры фосфопротеина вируса, недоступные для ядерного магнитного резонанса (который может дать только указание расстояний между аминокислотами, разделенными менее чем на 2 нм). Исследователи предполагают, что наблюдаемое образование определенных компактных форм может объяснить устойчивость к протеолизу – расщеплению белка.
В своем отчете о работе исследователи подчеркивают, что, а также мощный инструмент сам по себе: «Когда все молекулярные особенности, обнаруженные с помощью HS-AFM, объединены со складчатой локальной структурой, полученной с помощью ЯМР, объединенная информация позволяет количественно определить границы. структурных и динамических характеристик ВПЛ в более реалистичной манере по сравнению с изображениями, изображенными индивидуально, как показано для PNT [фосфопротеина вируса кори]."
Высокоскоростная атомно-силовая микроскопия
Атомно-силовая микроскопия была разработана в 1980-х годах и принесла разрешение в атомном масштабе, достигаемое с помощью сканирующей туннельной микроскопии (за которую в 1986 году была присуждена Нобелевская премия по физике), для непроводящих образцов. Он работает с использованием крошечного кантилевера с наноразмерным наконечником на конце, который либо ощущает поверхность, как иглу виниловой пластинки, либо постукивает по ней. Независимо от того, регулируя ли высоту наконечника или резонансную частоту постукивания, взаимодействие между наконечником и поверхностью обеспечивает сигнал, который можно использовать для создания изображения.
В то время как изображения АСМ принесли огромную пользу биологическим исследованиям, эти исследования снова смогли ускориться, когда Тошио Андо и его команда из Университета Канадзавы сообщили об атомно-силовом микроскопе, работающем на высокой скорости. Изображения с разрешением в атомном масштабе превратились в фильмы, дающие не только структуру, но и динамику. Предыдущая работа над упорядоченными белками, которые достаточно хорошо изучены, а также IDP способствует белку транскрипции хроматина (FACT), установила, что этот метод можно использовать для визуализации этих биомолекул без эффектов от контакта между наконечником и образцом, искажающих данные.
Внутренне неупорядоченные белки
Появление рентгеновской кристаллографии впервые дало исследователям четкое представление об огромном количестве структур биомолекул.
Но с сотнями тысяч структур биомолекул, проанализированных с помощью кристаллографии белков с тех пор, как этот метод впервые появился в 1930-х и 1950-х годах, стало появляться все больше свидетельств того, что не все белки имеют единую заданную структуру. Наблюдения противоречили преобладающей парадигме функции белка, определяемой фиксированной структурой.
За последние десять-двадцать лет повсеместное распространение этих внутренне неупорядоченных белков и их важность в клеточных функциях от передачи сигналов до регуляции транскрипции и последующей трансляции стали широко признанными.
В текущей работе исследователи изучают IDP, включая белок-1, связывающий полиглутаминовый тракт (PQBP-1, участвующий в различных процессах, таких как сплайсинг пре-мРНК, регуляция транскрипции, врожденный иммунитет и развитие нейронов), белки аутофагии (которые участвуют в удалении дисфункциональные компоненты клетки), содержащие внутренне неупорядоченные области (IDR) и нуклеопротеин вируса кори.