«Теперь мы можем отслеживать, куда попадает вирус в моделях COVID-19 на животных», – сказал вирусолог Луис Мартинес-Собридо, доктор философии.D., Профессор Texas Biomed и старший автор статьи. "Возможность увидеть, как вирус прогрессирует, и на какие органы и типы клеток он конкретно нацелен, будет большим подспорьем для понимания вируса и оптимизации противовирусных препаратов и вакцин."
В дополнение к отслеживанию вируса Мартинес-Собридо и его сотрудники уже начали использовать репортерные вирусы для проверки того, насколько хорошо нейтрализующие антитела работают против различных вызывающих озабоченность вариантов, как недавно сообщалось в Journal of Virology.
Включая свет
Чтобы создать репортерный вирус, Мартинес-Собридо и его команда объединили несколько передовых инструментов молекулярной биологии, чтобы добавить генетическую последовательность флуоресцентных или биолюминесцентных «репортерных» белков в генетический код вируса. Поскольку код вируса реплицируется и транскрибируется, то же самое происходит и с кодом светящихся белков.
В более раннем исследовании команда заменила один из генов вируса геном светящихся белков, но это привело к очень слабому сигналу – ген не был экспрессирован в достаточной степени, чтобы его можно было легко обнаружить у животных. Чтобы увеличить яркость, исследователи должны были выяснить, как заставить вирус производить большее количество репортерных белков.
Их решение: они вставили репортерный ген рядом с другим геном в SARS-CoV-2, в частности, геном, кодирующим белок нуклеокапсида. «Это наиболее экспрессируемый белок SARS-CoV-2», – сказал молекулярный биолог Chengjin Ye, Ph.D., сотрудник лаборатории Мартинеса-Собридо. На этот раз сигнал был настолько ярким, что "он почти ослепил меня, когда я посмотрел в люминесцентный микроскоп", – сказал он.
Более быстрые экраны
Репортерные белки работают в клетках и моделях живых животных в сочетании с системами визуализации, которые определяют длины волн света, излучаемого белками.
Возможность визуально наблюдать вирусную нагрузку и местоположение дает много преимуществ по сравнению с другими методами. Это намного проще и быстрее, экономя время и материалы.
«Вместо того, чтобы нуждаться в большой команде для проверки 2000 соединений, чтобы увидеть, работают ли они против вируса, один человек может сделать это с репортерным вирусом за несколько часов», – сказал Йе.
Это также позволяет отслеживать вирус у одного и того же животного на протяжении всего периода заражения и лечения, уменьшая количество животных, необходимое для получения аналогичных сведений.
Варианты отслеживания
Команда адаптировала репортерные вирусы для экспрессии белков разного цвета, прикрепленных к вызывающим озабоченность вариантам SARS-CoV-2, которые они описали в отдельной статье в Journal of Virology. Важно отметить, что этот подход позволил им проверить, насколько хорошо нейтрализующее антитело работает против двух вариантов в одном тесте одновременно.
«Это значительное преимущество для экономии времени и ресурсов, особенно с таким большим количеством основных материалов, таких как пластмассы и реагенты, которые пользуются таким высоким спросом и ограниченными предложениями из-за пандемии», – говорит Кевин Ким, доктор философии.D. кандидат и член лаборатории Мартинеса-Собридо. «По мере появления новых вариантов мы можем легко адаптировать систему и быстро проверять, насколько хорошо антитела работают против них."
Мощный и точный
Важно отметить, что группа продемонстрировала, что репортерные вирусы ведут себя так же, как и версия вируса дикого типа. Это связано с тем, что они не удаляли вирусные гены, и потому, что они разработали репортерный белок так, чтобы он немедленно отделялся от вирусного нуклеокапсидного белка, чтобы он функционировал нормально.
Их исследования показывают, что яркость репортерного белка хорошо коррелирует с вирусной нагрузкой, хотя накопление белка может происходить в течение нескольких дней, что в некоторых случаях приводит к немного более сильному сигналу.
Развитие основано на нескольких мощных методах, в том числе методах обратной генетики для создания рекомбинантного SARS-CoV-2, которые связывают вместе фрагменты генетического кода для создания полного вируса.
Мартинес-Собридо и его команда поделились своим рекомбинантным SARS-CoV-2 и неинфекционными материалами-предшественниками, называемыми плазмидами, более чем в 100 лабораториях по всему миру. Теперь они могут делиться репортерными вирусами с квалифицированными лабораториями с уровнем безопасности биологического сдерживания (BSL) -3, который необходим для работы с SARS-CoV-2, чтобы помочь бороться с все еще продолжающейся пандемией COVID-19.
«Мы считаем, что это наша ответственность – поделиться этими новыми инструментами и технологиями с другими исследователями по всему миру, чтобы помочь как можно быстрее положить конец пандемии», – сказал Мартинес-Собридо.
В число соавторов этих проектов входят Пак Джун-Гю, Иисус А. Сильвас, Десари Моралес Васкес и Хорди Б. Торреллес в Техасском биомеде; Жюльен Суриман и Ричард К. Племпер из Центра трансляционных антивирусных исследований при Университете штата Джорджия; Мишель Дж.
Лин и Александр Л. Greninger из Вашингтонского университета; Джеймс Дж. Коби, Марк Р. Уолтер и Майкл С. Пипенбринк из Университета Алабамы в Бирмингеме; и Хуан Карлос де ла Торре из Исследовательского института Скриппса.