«Наше понимание того, как ведет себя микробиом кишечника человека, все еще находится на начальной стадии, что препятствует крупномасштабным исследованиям по созданию биосенсоров из живых бактерий», – сказал Дэвид Риглар, доктор философии.D., бывший постдок Института Висса и HMS, который в настоящее время возглавляет исследовательскую группу в качестве научного сотрудника сэра Генри Дейла в Имперском колледже Лондона. «Эта работа обеспечивает высокопроизводительную платформу для идентификации генетических элементов в бактериях, которые реагируют на различные сигналы в кишечнике, что делает нас на один шаг ближе к разработке сложных сигнальных путей в бактериях, которые позволяют им выявлять и даже лечить заболевания в долгосрочной перспективе."
Новая платформа основана на предыдущей работе лаборатории преподавателя факультета Wyss Founding Core Памелы Сильвер, доктора философии.D. который разработал генетическую схему, состоящую из «элемента памяти», полученного из вируса, и синтетического «триггерного элемента», который вместе может обнаруживать и записывать наличие заданного стимула – первоначально деактивированной версии антибиотика тетрациклина.
Синтетическая схема была интегрирована в геномы E. coli, которые были введены живым мышам, которым затем вводили тетрациклин. Антибиотик заставил триггерный элемент в бактериальной цепи активировать элемент памяти, который «щелкнул», как выключатель, который оставался «включенным» до недели, так что бактерии «запомнили» присутствие тетрациклина. Затем сигнал "включен" легко считывался путем неинвазивного анализа экскрементов животных.
Затем команда продемонстрировала, что схема может быть настроена для обнаружения и регистрации тетратионата (встречающейся в природе молекулы, указывающей на наличие воспаления) в кишечнике живых мышей в течение шести месяцев после введения животным, показывая, что их система может использоваться для отслеживания сигналов, которые могут быть полезны для долгосрочной диагностики болезненных состояний кишечника.
Но тетратионат – это всего лишь одна молекула; Чтобы разработать новую диагностику на основе бактерий, исследователям нужен был способ быстро протестировать различные потенциальные триггерные элементы, чтобы увидеть, могут ли они реагировать на большее количество сигналов болезни.
Во-первых, они модифицировали генетическую схему, добавив ген устойчивости к антибиотикам, который активируется, когда элемент памяти переключается в состояние «включено», позволяя бактериям, которые «запоминают» триггер, выжить после воздействия антибиотика спектиномицина. Чтобы проверить свою обновленную схему на соответствие широкому спектру молекулярных сигналов, они создали библиотеку различных штаммов E. coli, каждый из которых содержит элемент памяти и уникальный триггерный элемент в своем геноме. Затем эту библиотеку бактериальных штаммов вводили в кишечник живых мышей, чтобы увидеть, активировались ли какие-либо триггерные элементы веществами в кишечнике мышей.
Когда они выращивали бактерии из образцов фекалий мышей в среде, содержащей спектиномицин, они обнаружили, что ряд штаммов вырос, что указывает на то, что их элементы памяти были включены во время прохождения через мышей. Два из этих штаммов, в частности, показали последовательную активацию, даже когда давали мышам изолированно, что указывает на то, что они были активированы условиями внутри кишечника мышей и могли служить сенсорами кишечных сигналов.
Исследователи повторили эксперимент, используя меньшую библиотеку E. coli, триггерные элементы которых представляли собой генетические последовательности, предположительно связанные с воспалением, десять из которых были активированы во время прохождения через мышей. Когда эту библиотеку вводили мышам с воспалением кишечника, один конкретный штамм показал более сильную реакцию памяти у мышей с воспалением по сравнению со здоровыми мышами, подтверждая, что он был в состоянии успешно регистрировать присутствие воспалительных биомолекул в кишечнике мыши и, таким образом, мог служить как живой монитор здоровья желудочно-кишечного тракта.
«Прелесть этого метода в том, что он позволяет нам идентифицировать биосенсоры, которые уже существуют в природе, которые мы не смогли бы сконструировать сами, потому что многие функции и регуляция бактериальных геномов все еще неизвестны», – сказал первый автор Александр Найдич, недавно защитивший кандидатскую диссертацию.D. в Серебряной лаборатории. «Мы действительно пользуемся невероятным генетическим разнообразием микробиома, чтобы быстро и эффективно найти возможные решения."
Дополнительные функции системы включают возможность записи сигналов, которые возникают в кишечнике хронически или временно, а также регулируемую чувствительность в виде последовательностей сайтов связывания синтетических рибосом (RBS), встроенных в триггерные элементы, которые могут контролировать скорость, с которой промоторы могут вызывать состояние «включенной» памяти в ответ на сигнал. Эти возможности позволяют точно настроить бактериальные биосенсоры для обнаружения определенных условий в кишечнике в течение длительного периода времени.
«Мы смогли превратить эту технологию из инструмента, который тестирует что-то одно, в инструмент, который может тестировать сразу несколько вещей одновременно, что не только полезно для определения новых потенциальных биосенсоров, но и может однажды превратиться в подобный пробиотику таблетка, содержащая сложные скопления бактерий, которые распознают и записывают несколько сигналов одновременно, что позволяет клиницистам «идентифицировать» болезнь и иметь большую уверенность в постановке диагноза », – сказала Памела Сильвер, которая также является исследователем Эллиота Т. и Onie H. Адамс, профессор биохимии и системной биологии в HMS.
"Постоянные успехи, достигнутые командой Silver в разработке живых клеточных устройств на основе генетической реинжиниринга микробиома, представляют собой совершенно новый подход к недорогой диагностике.
Этот подход может радикально изменить то, как мы взаимодействуем с биологическими системами и контролируем их, в том числе наши собственные тела ", – сказал директор-основатель Wyss Дональд Ингбер, M.D., Ph.D., который также является профессором сосудистой биологии Джуды Фолкмана в HMS и программе сосудистой биологии в Бостонской детской больнице, а также профессором биоинженерии в Гарвардском университете Джона А. Школа инженерии и прикладных наук Полсона.