Сегодняшний золотой стандарт диагностического теста COVID-19, в котором используется qRT-PCR – количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ПЦР), – чрезвычайно чувствителен, обнаруживая до одной копии РНК на микролитр, но для этого требуется специализированное оборудование, а время работы несколько часов и централизованная лабораторная база. В результате тестирование обычно занимает не менее одного-двух дней.
Исследовательская группа, возглавляемая учеными из лабораторий Дженнифер Доудна, Дэвида Сэвиджа и Патрика Хсу из Калифорнийского университета в Беркли, стремится разработать диагностический тест, который будет намного быстрее и проще в применении, чем qRT-PCR.
Теперь он объединил два разных типа ферментов CRISPR для создания теста, который может обнаруживать небольшие количества вирусной РНК менее чем за час. Дудна разделил Нобелевскую премию по химии 2020 года за изобретение редактирования генома CRISPR-Cas9.
Хотя новая методика еще не достигла той стадии, на которой она может соперничать по чувствительности с qRT-PCR, которая может обнаруживать всего несколько копий вируса на микролитр жидкости, она уже способна определять уровни вирусной РНК – около 30 копий на микролитр – достаточно для наблюдения за населением и ограничения распространения инфекций.
«Вам не нужна чувствительность ПЦР, чтобы в основном выявлять и диагностировать COVID-19 в сообществе, если тест достаточно удобен и достаточно быстр», – сказал соавтор Дэвид Сэвидж, профессор молекулярной и клеточной биологии. «Наша надежда заключалась в том, чтобы довести биохимию до такой степени, чтобы вы могли представить себе очень удобный формат в обстановке, где вы можете проходить тестирование каждый день, скажем, при входе на работу."
Исследователи опубликуют свои результаты онлайн 5 августа в журнале Nature Chemical Biology.
Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов разрешило несколько анализов на основе CRISPR для экстренного использования, но все они требуют начального этапа, на котором вирусная РНК амплифицируется, чтобы сигнал обнаружения, включающий высвобождение флуоресцентной молекулы, светящейся синим светом. – достаточно яркое, чтобы видеть. Хотя эта первоначальная амплификация увеличивает чувствительность теста до уровня, аналогичного qRT-PCR, она также вводит шаги, которые затрудняют выполнение теста за пределами лаборатории.
Команда под руководством Калифорнийского университета в Беркли стремилась достичь полезной чувствительности и скорости, не жертвуя простотой анализа.
«При обращении в пункт оказания медицинской помощи вы хотите иметь быстрый ответ, чтобы люди могли быстро узнать, инфицированы они или нет, например, до того, как вы сядете в самолет или поедете навестить родственников», – сказала руководитель группы Тина Лю. научный сотрудник лаборатории Дудны в Институте инновационной геномики (IGI), центре, ориентированном на CRISPR, в котором участвуют ученые Калифорнийского университета в Беркли и Калифорнийского университета в Сан-Франциско.
Помимо добавления этапа, еще одним недостатком начальной амплификации является то, что, поскольку она создает миллиарды копий вирусной РНК, существует большая вероятность перекрестного заражения в образцах пациентов. Новая методика, разработанная командой, меняет это положение и вместо этого усиливает флуоресцентный сигнал, устраняя основной источник перекрестного загрязнения.
Метод без амплификации, который они называют Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem (FIND-IT), может позволить провести быстрые и недорогие диагностические тесты для многих других инфекционных заболеваний.
«Хотя мы действительно начали этот проект с явной целью воздействия на COVID-19, я думаю, что этот конкретный метод может быть применим не только к этой пандемии, потому что, в конечном итоге, CRISPR можно программировать», – сказал Лю. "Итак, вы можете загрузить фермент CRISPR последовательностью, нацеленной на вирус гриппа, вирус ВИЧ или любой тип РНК-вируса, и система может работать таким же образом. В этой статье действительно утверждается, что эта биохимия является более простым способом обнаружения РНК и имеет возможность обнаруживать эту РНК в чувствительные и быстрые временные рамки, которые могут быть применимы для будущих применений в диагностике в местах оказания медицинской помощи."
В настоящее время исследователи создают такую диагностику с использованием FIND-IT, которая будет включать в себя этапы сбора и обработки образцов и запуска анализа на компактном микрофлюидном устройстве.
Использование тандемных белков Cas
Чтобы исключить целевую амплификацию из уравнения, команда использовала фермент CRISPR – Cas13 – для первого обнаружения вирусной РНК и другой тип белка Cas, называемый Csm6, для усиления сигнала флуоресценции.
Cas13 – ножницы общего назначения для разрезания РНК; как только он связывается со своей целевой последовательностью, заданной направляющей РНК, он готовится разрезать широкий спектр других молекул РНК. Эту инициируемую мишенью режущую активность можно использовать для сочетания обнаружения конкретной последовательности РНК с высвобождением флуоресцентной репортерной молекулы.
Однако сам по себе Cas13 может потребовать нескольких часов для генерации детектируемого сигнала, когда присутствуют очень низкие количества целевой РНК.
Идея Лю заключалась в том, чтобы использовать Csm6 для усиления эффекта Cas13. Csm6 – это фермент CRISPR, который определяет присутствие небольших колец РНК и активируется, чтобы разрезать широкий спектр молекул РНК в клетках.
Чтобы ускорить обнаружение Cas13, она и ее коллеги разработали специально сконструированную молекулу активатора, которая разрезается, когда Cas13 обнаруживает вирусную РНК.
Фрагмент этой молекулы может связываться и запускать Csm6, чтобы вырезать и высвободить яркую флуоресцентную молекулу из части РНК. Обычно молекула активатора быстро разрушается Csm6, тем самым ограничивая количество флуоресцентного сигнала, которое она может генерировать.
Лю и ее коллеги разработали способ химической модификации активатора, чтобы он был защищен от разложения и мог перезаряжать Csm6, многократно разрезая и высвобождая флуоресцентные молекулы, связанные с РНК. В результате чувствительность в 100 раз лучше, чем у оригинального активатора.
«Когда Cas13 активируется, он расщепляет этот маленький активатор, удаляя сегмент, который его защищает», – сказал Лю. "Теперь, когда он высвобожден, он может активировать множество различных молекул этого второго фермента, Csm6. Итак, одна мишень, распознаваемая Cas13, не просто приводит к активации его собственной способности разрезать РНК; это приводит к генерации гораздо большего количества активных ферментов, каждый из которых затем может расщеплять еще больше флуоресцентных репортеров."
Команда исследователей также включила оптимизированную комбинацию направляющих РНК, которая обеспечивает более чувствительное распознавание вирусной РНК с помощью Cas13. Когда это было объединено с Csm6 и его активатором, команда смогла обнаружить до 31 копии на микролитр РНК SARS-CoV-2 всего за 20 минут.
Исследователи также добавили выделенную РНК из образцов пациентов в анализ FIND-IT в микрожидкостном картридже, чтобы увидеть, можно ли адаптировать этот анализ для работы на портативном устройстве.
Используя небольшое устройство с камерой, они могли обнаруживать РНК SARS-CoV-2, выделенную из образцов пациентов, с чувствительностью, позволяющей фиксировать инфекции COVID-19 на их пике.
«Этот тандемный подход с нуклеазой – Cas13 плюс Csm6 – объединяет все в одну реакцию при одной температуре, 37 градусов Цельсия, поэтому он не требует высокотемпературного нагрева или нескольких шагов, как это необходимо для других диагностических методов», – сказал Лю. "Я думаю, что это открывает возможности для более быстрых и простых тестов, которые могут достичь сопоставимой чувствительности с другими текущими методами и потенциально могут достичь еще более высокой чувствительности в будущем."
Разработка этого метода обнаружения РНК без амплификации стала результатом переориентации исследований в IGI, когда началась пандемия, на проблемы диагностики и лечения COVID-19. В конечном итоге пять лабораторий Калифорнийского университета в Беркли и две лаборатории Калифорнийского университета в Калифорнии были вовлечены в этот исследовательский проект, одна из многих в рамках IGI.
«Когда мы начали это, мы надеялись создать что-то, что достигло бы паритета с PCR, но не требовало бы усиления – это было бы мечтой», – сказал Сэвидж, который был главным исследователем проекта. "А с точки зрения чувствительности у нас был разрыв в десять тысяч раз, чтобы прыгнуть. Мы сделали это примерно в тысячу раз; мы снизили его примерно на три порядка.
Итак, мы почти у цели. В апреле прошлого года, когда мы действительно начинали составлять карту, это казалось почти невозможным."
Работа поддержана Агентством перспективных оборонных исследовательских проектов (N66001-20-2-4033). Соавторами статьи являются сотрудники лабораторий Дженнифер Дудна, Дэвида Сэвиджа, Патрика Хсу, Лианы Ларо и Дэниела Флетчера из Калифорнийского университета в Беркли; Гэвин Нотт из Университета Монаша в Австралии; Мелани Отт и Кэтрин Поллард из институтов Гладстона и UCSF; и Мин Тан из Wainamics, научно-исследовательской фирмы в Плезантоне, Калифорния, которая производит микрофлюидные устройства.
Дудна, основатель IGI, а в настоящее время президент и председатель правления IGI, является председателем канцлера Ли Ка Шинг в Калифорнийском университете в Беркли и профессором химии, молекулярной и клеточной биологии. Сюй, Ларо и Флетчер – преподаватели кафедры биоинженерии.