"Никакой другой известный нам фактор не делает этого, поэтому мы были так сильно удивлены нашими выводами. Хотя NAC был открыт еще 25 лет назад, мы только сейчас начинаем понимать, насколько он важен для правильного функционирования клеток. Наше исследование показывает, что, помимо действия в качестве шаперона как на рибосоме, так и за ее пределами, NAC также способен распознавать зарождающиеся полипептидные цепи глубоко внутри рибосомного туннеля », – говорит профессор Эльке Дойерлинг, ведущий автор исследования и профессор молекулярной микробиологии в Констанц университет. "Мы уже знали, что NAC временно взаимодействует с трансляционными рибосомами.
Но мы не понимали, как именно NAC взаимодействует с рибосомой и с возникающими субстратами, чтобы регулировать сворачивание белка и его транспорт в эндоплазматический ретикулум (ER), что важно для жизнеспособности организма."
Исследователи провели биохимический, генетический и структурный анализ в модельной системе C. elegans, чтобы получить более подробное представление о том, как NAC идентифицирует и сортирует возникающие полипептидные цепи внутри рибосомного туннеля. «До недавнего времени мы предполагали, что самая ранняя точка взаимодействия между факторами, связанными с рибосомами, такими как шапероны, ферменты и транспортные белки, происходила тогда, когда возникающие полипептидные цепи выходили из рибосомного туннеля», – объясняет доктор Мартин Гамердингер, первый автор исследования вместе с Каном.
Кобаяши, ранее работавший в ETH Zurich, а в настоящее время доцент Токийского университета. "Обычно в этот момент цепи имеют длину около 40 аминокислот. Мы обнаружили, что NAC связывается с зарождающимися цепями длиной от десяти аминокислот или даже короче, и делает это внутри туннеля. Это делает NAC самым первым фактором, контактирующим с вновь синтезируемыми белками. Мы даже подозреваем, что он способен определять, когда первые две аминокислоты зарождающегося белка соединяются друг с другом."
Как исследователи смогли показать, используя комбинацию криоэлектронной микроскопии, масс-спектрометрии и биохимического анализа, включая серию экспериментов по сайт-специфическому сшиванию, NAC вставляет положительно заряженный и очень гибкий N-концевой домен своего ?-субъединица (N-?NAC) в рибосомный туннель, который по большей части выстлан отрицательно заряженной рибосомной РНК. «Наше исследование демонстрирует, что NAC может определять активность трансляции внутри туннеля и, что более важно, что он способен определять характер синтезируемых белков. По крайней мере, это наша текущая гипотеза », – говорит Эльке Дойерлинг.
Как только они покидают рибосомный туннель, возникающие белковые цепи могут продолжать идти по ряду различных путей биогенеза: некоторые передаются другим факторам, которые сопровождают эти цепи к предполагаемому месту назначения где-то еще внутри клетки. Некоторые модифицируются ферментами, другим требуется поддержка шаперонов для достижения естественной структурной складки. Как комментирует Мартин Геймердингер: «Если то, что мы предполагаем о раннем механизме распознавания NAC, верно, то этот комплекс является единственным наиболее важным механизмом сортировки белков, о котором мы знаем.
Это объяснило бы, как клетки управляют сложными процессами и реакциями, которые происходят в связи с возникающими полипептидными цепями, когда они выходят из рибосомного туннеля."Соответственно, следующее исследователи планируют проверить, является ли N-?Домен NAC может определять характер растущих белков внутри рибосомного туннеля и то, как он побуждает их войти в правильные пути биогенеза белков.
«Далее мы обнаружили, что NAC действует как молекулярный фильтр, предотвращая взаимодействие неактивных рибосом или рибосом на ранних стадиях трансляции с транслоконом ER, т.е.е. с комплексом, который транспортирует растущие полипептиды с целевой сигнальной последовательностью в эндоплазматический ретикулум. Нерегулируемые взаимодействия рибосома-транслокон могут привести к тому, что неправильные белки попадут в эндоплазматический ретикулум, с одной стороны, и к истощению белковых факторов, которые на самом деле необходимы где-то еще, с другой », – говорит Эльке Дойерлинг. "Таким образом, NAC отвечает за то, что различные этапы биогенеза белка становятся более эффективными и специфичными."
В то время как N-?Домен NAC, по-видимому, отвечает за восприятие и, возможно, за сортировку возникающих полипептидных цепей, еще один домен NAC, N-?НАК, взаимодействует с ?-домен и сам с собой, чтобы регулировать активность NAC на рибосомах. «Это тоже то, о чем мы раньше не знали», – объясняет Мартин Геймердингер. "Без N-?NAC, NAC будет слишком сильно связываться с рибосомой, мешая происходящим там процессам трансляции важных белков. Нам еще предстоит понять, как именно работает эта функция автоматического подавления NAC, но кажется очевидным, что N-?NAC подавляет связывание рибосом."Как и в экспериментах in vivo с C. elegans ясно показали, что черви, экспрессирующие вариант NAC, у которого отсутствует аутоингибирование и демонстрирует повышенное связывание с рибосомами, задерживаются в развитии из-за снижения скорости синтеза белка и нарушения трансляции, что явно демонстрирует дефекты, вызванные неправильной регуляцией NAC-рибосомы.
Примечание: активность NAC по обнаружению туннелей важна для жизнеспособности организма и важна для регуляции транспорта белка в эндоплазматический ретикулум; основные последствия для общего понимания трансляции и созревания белков в клетках.