Как сообщает Nature Biotechnology, команда под руководством Пэн Инь, доктора философии.D., в Гарвардском институте биологической инженерии Висса и Гарвардской медицинской школе (HMS) заполнили эту пустоту новым подходом на основе ДНК-нанотехнологий под названием Immuno-SABER, сокращенно от «Иммуноокрашивание с усилением сигнала путем обменной реакции.«Этот метод сочетает в себе специфичность нацеливания на белок общедоступных антител со стратегией амплификации сигнала на основе ДНК, которая обеспечивает высоко мультиплексную визуализацию многих белков в одном образце с предварительно программируемыми и настраиваемыми сигналами флуоресценции на каждом целевом участке. Команда проверила свой метод на широком спектре препаратов клеток и тканей.
«Мы продемонстрировали, что Immuno-SABER дает возможность независимо настраивать интенсивность сигнала для отдельных белковых мишеней в 5–180 раз, с возможностью мультиплексирования, что позволяет одновременно обнаруживать множество белков. Вместе с его скоростью, относительной простотой использования и низкими затратами, этот метод имеет потенциал для ускорения текущих крупномасштабных исследований по картированию белков и усилий по обнаружению биомаркеров во многих тканях и заболеваниях », – сказал Пэн Инь, сотрудник Института Висс. Член факультета.
Основываясь на достижениях своей группы в использовании технологий штрих-кодирования и усиления сигналов, основанных на нанотехнологиях ДНК, Инь недавно был также выбран в качестве победителя программы Human BioMolecular Atlas Program (HuBMAP) и призера проекта Human Cell Atlas Project.
Он также является соруководителем инициативы молекулярной робототехники Института Висс и профессором системной биологии в HMS.
Антитела являются наиболее распространенными реагентами для обнаружения белков как в исследовательских, так и в клинических условиях. Обычно они помечаются флуоресцентными пятнами, чтобы их можно было обнаружить под микроскопом. Однако обычные методы окрашивания антител обычно позволяют использовать одновременно не более пяти различных красителей, а целевые белки могут значительно различаться по своему содержанию, что затрудняет различение редких белковых мишеней с высокой чувствительностью от фоновой флуоресценции, которая проявляется во многих тканях.
Immuno-SABRE использует метод «реакции обмена праймеров» (PER), ранее описанный группой Инь, для синтеза длинных конкатемеров коротких последовательностей праймеров ДНК с помощью каталитической шпилечной структуры ДНК. Конкатемеры, генерируемые PER, прикрепляются с помощью коротких последовательностей маркеров к штрих-кодам ДНК на антителах, которые связываются с белками-мишенями в фиксированных образцах клеток и тканей с высокой специфичностью. В сайте-мишени конкатемеры SABER обеспечивают каркас с множеством сайтов связывания для комплементарных флуоресцентных олигонуклеотидов («формирователи изображений») и, таким образом, средства для усиления сигнала, исходящего от каждого белка-мишени.
«Кодируя антитела с помощью уникальных коротких последовательностей ДНК и применяя Immuno-SABER, мы можем одновременно визуализировать несколько белковых мишеней в одном образце и с высокой специфичностью. Это, по сути, открывает способ анализа разнообразия белков, присутствующих в тканях, надежным и комплексным образом », – сказал со-первый и соавтор-корреспондент Синем Сака, Ph.D., который работает научным сотрудником в команде Инь.
Команда значительно увеличила потенциал мультиплексирования своего подхода Immuno-SABER, объединив его с ранее разработанной техникой «ДНК-обмена». При ДНК-обмене формирователи изображений, которые маркируют один набор белков-мишеней, смываются и заменяются другим набором формирователей изображений, маркирующих другую группу белков-мишеней, и это можно повторять несколько раз.
Ранее разработанные методы детектирования белков с высокой степенью мультиплексирования, которые работают за счет повторения некоторых из их ключевых шагов на разных белковых мишенях, как правило, страдают от неоптимальной чувствительности или требуют значительного времени (низкая пропускная способность) и изящества для выполнения. «Exchange-SABRE» обеспечивает высокую чувствительность за один этап окрашивания и амплификации, а также высокую производительность и мультиплексирование за счет нескольких этапов быстрой смены имидж-сканера », – сказал соавтор исследования Ю Ван, аспирант в команде Инь. «В качестве доказательства концепции мы визуализировали 10 различных белков в криосрезов сетчатки глаза мыши."
Одним из наставников Ванга был соавтор Джордж Черч, доктор философии.D., который является основным преподавателем Института Висса и профессором генетики в HMS и медицинских наук и технологий в Гарвардском университете и Массачусетском технологическом институте (MIT).
Другой ключевой аспект Immuno-SABRE, облегчающий параллельное обнаружение множества белков одновременно, – это его способность настраивать силу сигнала. Команда достигла этого путем сборки более сложных разветвленных структур из конкатемеров, генерируемых PER, которые содержат большее количество сайтов связывания для флуоресцентных формирователей изображений. «Программирование сложности структур конкатемеров на основе PER позволяет нам настраивать силу сигнала в зависимости от количества определенных белков. «Мы можем в то же время визуализировать редкие белки с разветвленными продуктами SABRE, которые обеспечивают более высокое усиление сигнала, и обильные белки с линейными продуктами SABER», – сказал Сака.
В своем исследовании команда объединила линейные и разветвленные конкатемеры SABRE, например, чтобы одновременно визуализировать шесть белковых мишеней с разным содержанием и клеточным расположением в образцах миндалин человека.
Существующий набор технологий визуализации на основе нанотехнологий ДНК, включая DNA-PAINT и Discrete Molecular Imaging, созданный командой Инь, продвинул область микроскопии сверхвысокого разрешения, которая позволяет исследователям изучать отдельные молекулы в их обычных местах. Чтобы достичь такого же высокого разрешения белков в более сложных тканевых средах, команда объединила Immuno-SABER с методом, известным как «расширяющая микроскопия», который ранее был разработан соавтором Эдвардом Бойденом, доктором философии.D., Oни. Ева Тан, профессор нейротехнологии в Массачусетском технологическом институте.
Метод расширения искусственно раздувает фиксированные ткани до больших объемов, что увеличивает расстояние между отдельными молекулами и, таким образом, улучшает их эффективное разрешение без необходимости использования специальных инструментов. «Сочетание расширяющей микроскопии с Exchange-SABRE одновременно дает нам возможности высокого мультиплексирования, пропускной способности и разрешения, необходимые для более эффективного продвижения таких усилий, как создание молекулярных атласов для человеческого тела», – сказал Ван.
"Команда Пэн Инь снова демонстрирует, как они могут программировать сконструированные молекулы ДНК для выполнения определенных задач, таких как молекулярные роботы, в этом случае позволяя нам одновременно визуализировать расположение многочисленных белков в клетках и тканях человека с высоким разрешением, что должно значительно ускорить открытие молекулярные механизмы биологического контроля, а также новые биомаркеры болезней ", – сказал директор-основатель Wyss Institute Дональд Ингбер, штат Массачусетс.D., Ph.D., который также является профессором биологии сосудов в HMS, программы сосудистой биологии в Бостонской детской больнице и профессором биоинженерии в Гарвардском университете Джона А. Школа Полсона инженерных и прикладных наук (SEAS).