«Большинство исследований нецелевого редактирования оснований было сосредоточено на ДНК, но мы обнаружили, что эта технология также может вызывать большое количество изменений РНК», – говорит Дж. Кейт Джунг, доктор медицинских наук, отделение патологии MGH и старший автор отчета о природе. "Это удивительное открытие предполагает, что при рассмотрении непреднамеренных нецелевых эффектов редакторов оснований в клетках необходимо смотреть не только на генетические изменения. Мы также показываем возможность уменьшения этих эффектов путем создания вариантов, которые выборочно уменьшают редактирование РНК вне мишени, сохраняя при этом намеченную активность ДНК на мишени."
В отличие от нуклеаз, редактирующих ген CRISPR-Cas, которые индуцируют целевые двухцепочечные разрывы ДНК для внесения генетических изменений, редакторы оснований CRISPR могут изменять один нуклеотид в цепи ДНК, не вызывая таких разрывов.
Джунг объясняет, что хотя нуклеазы CRISPR-Cas можно сравнить с ножницами, базовые редакторы можно сравнить с карандашом. Слитые белки, которые используют модифицированную форму CRISPR-Cas для наведения на целевой сайт, редакторы баз используют фермент, называемый дезаминазой, для модификации определенного нуклеотида, тем самым создавая изменения, которые могут привести к конкретным изменениям ДНК – например, превращение цитозина в тимин.
Хотя большинство исследователей сосредоточили свое внимание на деятельности редакторов оснований по редактированию ДНК, дезаминаза в наиболее часто используемом редакторе преобразования цитозина в тимин была первоначально идентифицирована из-за ее способности модифицировать РНК. Это побудило команду MGH исследовать, может ли он вызывать эффекты нецелевой РНК. Их эксперименты с клеточными линиями как печени, так и эмбриональных почек показали, что, хотя обычно используемый редактор базовых данных, который они тестировали, вызывал эффективные изменения в целевом участке ДНК, он также приводил к десяткам тысяч изменений цитозина в урацил во всем транскриптоме, т.е. диапазон транскрибируемой РНК в клетке.
Они обнаружили аналогичные результаты, когда протестировали один из новых редакторов баз, нацеленных на аденин.
Чтобы изучить возможность уменьшения или устранения нежелательных изменений РНК, команда MGH провела скрининг 16 редакторов с модифицированными версиями ферментов дезаминазы, выявив два, которые были столь же эффективны, как и исходная версия, в индуцировании эффектов ДНК-мишени при значительно меньшем количестве изменений РНК. Фактически, эти варианты SECURE (селективное сдерживание нежелательного редактирования РНК) были даже более точными, чем неизмененная дезаминаза, в индуцировании желаемых изменений ДНК.
«Мы были весьма удивлены количеством – десятками тысяч – изменений РНК и частотой этих изменений, которые мы наблюдали с двумя классами базовых редакторов», – говорит ведущий автор Джулиан Грюневальд, доктор медицины, MGH Molecular Pathology и Harvard Medical.
Школа. «Мы также были рады видеть, что можем существенно уменьшить количество нежелательных изменений РНК с помощью наших вариантов базового редактора SECURE."
Чон отмечает, что изучение любого потенциального воздействия этих эффектов РНК на экспериментальные и клинические применения редактирования базы CRISPR – важный следующий шаг, который предпринимает его команда. «Мы показали, что широко используемый редактор оснований цитозина, который мы изучали, оказывает умеренное влияние на жизнеспособность клеток при экспрессии в одной клеточной линии человека, в то время как варианты SECURE – нет. Для исследовательских приложений ученым, использующим базовые редакторы, необходимо будет учитывать потенциальные эффекты РНК вне мишени в своих экспериментах.
Для терапевтических применений наши результаты также служат аргументом в пользу ограничения продолжительности выражения базового редактора до минимально возможного времени, а также важности минимизации и учета потенциальных воздействий этих эффектов при оценке безопасности."
Профессор патологии Гарвардской медицинской школы, Джунг добавляет: «Еще одна важная область текущей работы – это расширение наших усилий по минимизации этих нежелательных изменений РНК, не соответствующих цели. В настоящее время мы пытаемся разработать SECURE редакторы оснований аденина и изучаем нецелевые эффекты РНК редакторов оснований цитозина, которые используют другие ферменты дезаминазы, чем тот, который был в редакторе, который мы исследовали. Наша цель – создать набор базовых редакторов с минимальными действиями по редактированию РНК, которые можно использовать как для исследовательских, так и для терапевтических целей."
Плазмиды, кодирующие редакторы базовых вариантов SECURE, будут доступны в репозитории плазмид Addgene по адресу http: // www.addgene.org / crispr-cas.
Дополнительными соавторами статьи в Nature являются Ронгхао Чжоу, Сара Гарсиа, доктор философии, Соумья Айер, доктор философии, Калеб Ларо и Мартин Арье, доктор философии, все из отдела молекулярной патологии MGH.
Работа поддержана контрактом с Агентством перспективных оборонных исследовательских проектов HR0011-17-2-0042; Национальные институты здравоохранения предоставляют гранты RM1 HG009490 и R35 GM118158, а также премию Десмонда и Энн Хитвуд за научные исследования в MGH.