Исследование открыло новые возможности для геномного редактирования этих диких видов и изолятов бактерий, таких как те, которые имеют клиническое и экологическое значение, и те, которые образуют микробиом человека. Он также предоставил основу для использования других систем CRISPR-Cas, широко распространенных в прокариотических геномах, и расширения наборов инструментов на основе CRISPR. Исследование опубликовано в ведущем научном журнале Nucleic Acids Research.
Фон
Система CRISPR-Cas включает в себя адаптивную иммунную систему прокариот, которая обезоруживает вторгшиеся вирусы, расщепляя их ДНК.
Благодаря своей уникальной способности направлять и изменять последовательности ДНК, CRISPR-Cas используется в качестве метода редактирования генома следующего поколения. Метод основан на системе CRISPR / Cas9 класса 2 типа II, которая произвела революцию в генетике и биомедицинских исследованиях множества организмов и была удостоена Нобелевской премии по химии 2020 года. Однако системы CRISPR-Cas Класса 2 представляют только ?10% систем CRISPR-Cas закодированы естественным образом в прокариотах. Их приложения для редактирования бактериальных геномов довольно ограничены.
Примечательно, что системы CRISPR-Cas, принадлежащие к разным классам и типам, постоянно идентифицируются, и они служат глубоким резервуаром для расширения наборов инструментов на основе CRISPR. Самая разнообразная и широко распространенная система CRISPR-Cas – это система типа I, на которую приходится 50% всех идентифицированных систем CRISPR-Cas, и у нее есть потенциал для расширения наборов инструментов на основе CRISPR с отличительными преимуществами, недоступными для систем класса 2, например высокая специфичность, минимальное отклонение от цели и возможность делеции больших фрагментов.
Однако система CRISPR-Cas типа I опирается на многокомпонентный эффекторный комплекс, называемый каскадом, для вмешательства в ДНК, которая не может быть легко передана гетерологичным хозяевам, что препятствует широкому применению этих широко распространенных в природе CRISPR для редактирования генома и терапии.
Основные выводы
Ранее команда определила высокоактивную систему CRISPR-Cas типа I-F в клиническом полирезистентном P. aeruginosa PA154197, который был изолирован от случая инфекции кровотока в больнице Королевы Марии.
Они охарактеризовали эту систему CRISPR-Cas и успешно разработали метод редактирования генома, применимый к изоляту MDR, на основе этой системы CRISPR-Cas нативного типа I-F. Этот метод позволил быстро идентифицировать детерминанты устойчивости клинического изолята МЛУ и разработать новую стратегию борьбы с резистентностью (Cell Reports, 2019, 29, 1707-1717).
Чтобы преодолеть барьер переноса комплексного каскада типа I к гетерологичным хозяевам, в этом исследовании команда клонировала весь тип IF-казоперона в способный к интеграции вектор mini-CTX и доставила кассету гетерологичным хозяевам путем конъюгации, подхода переноса ДНК. обычен в природе.
Вектор mini-CTX обеспечил интеграцию всего Cascade в консервативный генетический локус attB в геноме гетерологичных хозяев, что позволило им нести «нативную» систему CRISPR-Cas I-F типа, которая может стабильно экспрессироваться и функционировать. Команда показала, что переданный каскад типа I-F демонстрирует значительно большую интерференционную способность ДНК и более высокую стабильность штаммов, чем переносимая система Cas9, и может использоваться для редактирования генома с эффективностью (> 80%) и простотой, т.е.е. путем одноэтапной трансформации одной редактирующей плазмиды.
Кроме того, они разработали усовершенствованную систему для переноса, которая включает в себя как высокоактивный каскад I-F типа, так и рекомбиназу, чтобы способствовать применению системы в штаммах с плохой гомологичной рекомбинационной способностью, диким P. aeruginosa без информации о последовательности генома, а также у других видов Pseudomonas. Наконец, введенные гены каскада типа I-F могут быть легко удалены из геномов хозяина посредством делеции больших фрагментов ДНК, опосредованной I-F каскадом, что приводит к безрубцовому редактированию генома в клетках-хозяевах.
Также было продемонстрировано применение переносимой системы для репрессии генов, подчеркнув надежные и разнообразные применения разработанной системы CRISPR переносимого типа I-F.
Доктор Айсин Ян предсказала, что этот новый метод будет распространен на редактирование не только патогенов, но и микробиома для улучшения здоровья человека, сказала она: «Мы считаем, что технология и методы лечения на основе CRISPR принесут новые надежды на борьбу с супербактериями в будущем."