Но наряду с обещанием регенеративной персонализированной медицины CRISPR также может иметь значительные ограничения безопасности. CRISPR может не редактировать в нужном месте (так называемые эффекты гена вне цели) или быть не очень эффективным (успешное редактирование может быть достигнуто только примерно в 10% случаев для каждой доступной целевой клетки).
Эти ограничения разочаровали таких ученых, как Дэвид Брафман из Университета штата Аризона, специалист по клеточной биоинженерии.
Первоначальные надежды Брафмана заключаются в том, чтобы использовать редактирование генов, чтобы раскрыть причины исследований в его лаборатории нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера.
«Мы изучаем нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, и используем стволовые клетки для изучения конкретных мутаций или факторов риска, связанных с болезнью Альцгеймера», – сказал Брафман, член факультета биомедицинской инженерии в Айре А. Фултонские школы инженерии. «Мы не обязательно являемся лабораторией по разработке инструментов для редактирования генов, но мы столкнулись с трудностями при создании линий стволовых клеток с использованием традиционного подхода к редактированию на основе CRISPR. По причинам, которые до сих пор неизвестны, стволовые клетки действительно устойчивы к такого рода генетическим модификациям."
Зеленый свет означает идти
Теперь Брафман, используя новое обновление технологии редактирования базы CRISPR, первоначально разработанной в лаборатории Дэвида Лю в Гарварде, значительно превзошел предыдущие усилия, выполнив высокоточное редактирование одной базы ДНК с эффективностью до 90% человеческого ствола. клетки. Результаты опубликованы в журнале Stem Cell Reports.
«Раньше с CRISPR это было просто случайное предположение», – сказал Брафман. "Итак, если вы выбираете случайные стволовые клетки и эффективность низка, вы, скорее всего, получите только 10% или 5%, потому что вы не знаете, были ли внесены изменения – клетка не сообщает вам."
Лаборатория Брафмана разработала новый метод TREE (сокращенно от временного репортера для редактирования обогащения, или TREE), который позволяет производить массовое обогащение популяций клеток с редактированием оснований ДНК – и впервые обеспечивает высокую эффективность в стволовых клетках человека. линии.
«Большинство исследований проводится на иммортализованных клеточных линиях или линиях раковых клеток, которые относительно легко редактировать», – сказал Брафман. "Это первый пример использования редакторов оснований в плюрипотентных стволовых клетках, которые представляют собой очень ценную популяцию клеток для генетической модификации. Мы предполагаем, что этот метод будет иметь важное значение для использования линий стволовых клеток человека в биологии развития, моделировании заболеваний, скрининге лекарств и тканевой инженерии »
В прошлом году они показали, что их подход TREE может работать с линиями человеческих клеток, но хотели еще больше продвинуть технологию, чтобы найти способ быстрого и эффективного редактирования линий человеческих стволовых клеток.
В отличие от CRISPR, который пересекает обе стойки ДНК, их метод TREE делает в ДНК только одноцепочечный разрез.
Например, когда единственное основание ДНК успешно редактируется с C на T, белок подает сигнал, меняя цвет с синего на зеленый.
«Теперь, если ячейка говорит вам:« Если я горю зеленым, у меня есть 90% -ный шанс, что меня отредактируют, вам больше повезет с идентификацией отредактированных популяций », – сказал Брафман. "Затем вы можете исключить все ячейки, которые не редактируются. Мы изолируем отдельные клетки, которые светятся зеленым, а затем выращиваем их в клональные популяции, которые вы можете расширять до бесконечности."
Ориентация на болезнь Альцгеймера
Плюрипотентные стволовые клетки ценятся в регенеративной медицине, потому что они обладают способностью становиться или дифференцироваться в клетки любого типа в организме человека.
Брафман объясняет, что существует два основных источника: «эмбриональные стволовые клетки, которые происходят из внутренней клеточной массы доимплантационной бластоцисты, а также индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные в результате взятия соматических клеток, таких как кожа или кровь, у пациентов."
Лаборатория Брафмана использует индуцированные плюрипотентные стволовые клетки для своих исследований.
«Для этого исследования мы использовали плюрипотентные стволовые клетки как от здоровых пациентов, так и от пациентов с болезнью Альцгеймера.
Некоторые из генов, которые мы хотели модулировать, связаны с болезнью Альцгеймера. Большинство пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, страдают поздним началом или спорадической болезнью Альцгеймера."
Чтобы подтвердить свою концепцию, они нацелены на ген APOE, который может быть трех видов. Один из трех вариантов гена, называемый APOE4, связан с более высоким риском позднего начала болезни Альцгеймера.
Для исследования они ввели отдельные изменения на основе ДНК в ген APOE.
«Вот почему мы заинтересованы в этих ячейках», – сказал Брафман. "Они представляют собой нейроны и различные типы клеток центральной нервной системы у пациентов с этими различными факторами риска. Затем мы можем понять, почему вариант APOE может увеличивать или уменьшать риск, и затем мы можем начать нацеливаться на те пути, которые затронуты."
TREE может не только вносить отдельные изменения в ДНК гена APOE4, но, в отличие от CRISPR, вносить высокоточные исправления в обе копии гена APOE4, которыми обладают люди.
«Традиционный подход CRISPR заключается в том, что вам нужно отредактировать один раз, чтобы получить гетерозиготное редактирование, затем изолировать этот клон, отредактировать еще раз, чтобы получить еще одно гетерозиготное редактирование», – сказал Брафман. "Так что это очень неэффективно. Мы производим гомозиготные правки с эффективностью, приближающейся к 90%. Я не видел других технологий, которые могли бы сделать это в плюрипотентных стволовых клетках."
Кроме того, TREE можно использовать для создания критических нокаутных мутаций генов в линиях стволовых клеток. «Самый фундаментальный эксперимент, который вы можете провести, если ген имеет важное значение для болезни, развития или физиологии, – это отключить его», – сказал Брафман. Это открывает целый ряд вопросов, на которые мы можем ответить.
Используя APOE в качестве примера, теперь мы можем выбить APOE в этих ячейках, если у вас вообще нет APOE. Это полезно? Вредный?
Или без разницы?"
Сложные случаи
В то время как такие заболевания, как серповидно-клеточная анемия или кистозный фиброз, вызываются отдельными мутациями в ДНК, большинство заболеваний и основных причин смерти, таких как болезнь сердца или высокое кровяное давление, являются сложными и включают в себя несколько генов. Брафман также хотел устранить комплексные первопричины болезни Альцгеймера.
«В частности, это связано с болезнью Альцгеймера, здесь может быть несколько факторов риска, которые действуют согласованно, поэтому нам нужен был способ одновременного внесения нескольких изменений в плюрипотентные стволовые клетки. Потому что в противном случае вам пришлось бы использовать этот последовательный итеративный подход, когда вы вводите одно редактирование, изолируете клональную популяцию, вводите другое редактирование и т. Д.
Они успешно продемонстрировали, что TREE можно использовать для создания новых линий стволовых клеток, которые одновременно редактировались в нескольких местах расположения генов. Их результаты показали, что более 80% стволовых клонов были нацелены на все три разных генных сайта, и все клоны редактировали обе копии гена.
«Мы обнаружили, что если вы мультиплексируете, вы по-прежнему получаете такую же эффективность редактирования, как если бы вы редактировали только один аллель», – сказал Брафман. «Теперь мы можем использовать эти клетки в качестве моделей in vitro для изучения болезни и скрининга лекарств."
Брафман надеется, что их новые инструменты вызовут интерес в сообществе редакторов генов и подтолкнут других к новым открытиям.
«Мы хотим и дальше расширять этот набор инструментов», – сказал Брафман. "Мы уже получили высокий уровень интереса со стороны других ученых, которые будут использовать это для создания своих собственных клеточных линий. Это хорошая вещь."
Финансирование этой работы было предоставлено Национальными институтами здравоохранения (R01GM121698 – Дэвиду Брафману, R21AG056706 – D.А.B, R01GM106081 по X.W.) и Комиссия по биомедицинским исследованиям Аризоны (ADHS16-162401 – D.А.Б).